XTerra色譜柱怎么連接到HPLC系統
a.色譜柱的連接
需要的工具:3/8英寸扳手和5/16英寸扳手各一個
請避免在硬物上敲擊色譜柱或將色譜柱從高處掉落，這樣可能會造成柱床斷裂，影響柱性能。
使用外徑 1/16英寸的不銹鋼管連接色譜柱，只有不銹鋼管與色譜柱接頭的末端完全吻合，沒有死體積或漏液的情況，才能獲得最好的分離效果。當需要擰緊或擰松色譜柱連接時，請將5/16英寸的扳手置于不銹鋼管的螺絲位置，將3/8英寸的扳手置于色譜柱端口的六面體位置。
沃特世公司的色譜柱具有Parker和Waters兩種不同型式的接頭，因此與之連接的管路的錐箍也有兩種型式。如圖1所示:Waters型式的接頭要求露出錐箍的不銹鋼管路長度為0.130英寸，而Parker型式的接頭則要求露出錐箍的不銹鋼管路長度為0.090英寸。
只有在管路與色譜柱正確連接的系統中，管路與色譜柱接口末端完全吻合，沒有死體積，才能獲得最好的分離效果。
Parker接頭與Waters型式色譜柱連接會產生死體積，而流路中死體積的存在必然降低色譜柱的柱效。解決這種問題的辦法是:切掉原來的錐箍接頭，用一個新的錐箍連接到管路上做成一個新的接頭。請注意:在擰緊螺絲前，要保證露出錐箍的不銹鋼管路長度和新的色譜柱接口匹配。
Waters接頭與Parker型式色譜柱連接時，在錐箍與色譜柱接口完全吻合之前，不銹鋼管路就已經頂到了色譜柱接口的末端。這樣，錐箍與色譜柱接口之間會留下縫隙而產生漏液。解決這類問題的方法有兩種:
1)用力擰緊不銹鋼管路上的螺絲時錐箍前移與柱接口完全吻合。請注意:用力不可過大以免損壞柱接口或將不銹鋼管擰斷。
2)切掉原先的錐箍接頭，將一個新的錐箍連接到管路上做一個新的接頭。
用沃特世公司一件式或兩件式PEEK接頭(PSL613315一件式或PSL613322和PSL613316的兩件式接頭)代替傳統的不銹鋼壓緊螺絲可以解決上述兩類問題，因為PEEK接頭允許自由調節露出錐箍之外的不銹鋼管路長度，而且可以手動擰緊，簡單方便。更方便的選擇是使用SLIPFREE連接器，它具有如下特點:
●可將管路推入接口，保證無死體積連接
●手緊后即可耐受10,000 psi壓力
●拆開連接后可以重新適應新的色譜柱接口，與所有商品化的接口兼容
●不銹鋼合金表面穩定性好，且沒有顆粒物質產生
●獨特的設計將固定作用與密封作用分開
b.測量系統的譜帶擴展體積以及系統偏差
圖6說明了管路內徑對系統譜帶擴展和峰形的影響，可以看出，大內徑的連接管路會產生更大的譜帶擴展，靈敏度更低。
以下將介紹如何測量系統的譜帶擴展體積和系統偏差。
注意:測試需要在配置單波長紫外檢測器的HPLC系統上進行(不要用二極管矩陣檢測器)
a)取下色譜柱，換上一個零死體積的兩通
b)將泵流速設為1ml/min
c)用流動相將測試混合物稀釋，使檢測器靈敏度達0.5~1AUFS(可使用包含尿嘧啶、對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯的混合物，沃特世訂貨號WAT034544)
d)進樣2~5μL
e)測量4.4%峰高處的峰寬(5-sigma方法):
5-sigma 譜帶擴展體積(μL)=峰寬(min)×流速(ml/min)×(1000μL/1ml)
系統偏差(μL2)= (5-sigma展寬2)/25
典型的HPLC系統譜帶擴展體積應該在70μL至130μL之間(或偏差400μL2±36μL2)，對于使用微徑柱(如2.1mmI.D.的色譜柱)的系統，譜帶擴展體積不得超過20~40μL(或偏差不得超過16μL2~64μL2)。
c.測量梯度延遲體積(或滯后體積)
為了成功地進行梯度方法的轉移，需要在兩臺儀器上用相同的方法測試梯度滯后體積。如下列出了測量梯度滯后體積的方法:
a)取下色譜柱，換上一個零死體積的兩通
b)準備流動相A(純溶劑，如甲醇)和流動相B(流動相A中加入有UV吸收的樣品，如含0.1%(v/v)丙酮的甲醇溶液)
c)用流動相A平衡系統直到基線平穩
d)設定檢測器波長，以待測物的最大吸收為準(丙酮采用265nm)
e)流速設為2mL/min，編輯一個10分鐘內0~100%B的線性梯度(具體的條件可以適當調整，但需要保證梯度體積不低于20mL)，然后保持100%B，采集數據f)首先測量50%吸光度處對應的梯度中點時間t1/2(在起始和最終等度區間的基線之間的垂直距離的一半處,如圖8所示)
g)將梯度中點時間t1減去梯度時間t。的一半(本例為5分鐘)即可得到梯度滯后時間t。
h)將梯度滯后時間tD乘以流速(2ml/min)即可得到滯后體積VD
提示:對快速梯度方法來講，梯度滯后體積不得超過1mL，如果超過1mL，請參考系統優化建議部分的內容來減小系統體積。
