常規(guī)反相分析色譜柱柱清洗與再生的推薦步驟

更新時(shí)間:2025-01-15      點(diǎn)擊次數(shù):710

常規(guī)反相分析色譜柱柱清洗與再生的推薦步驟


  壓力升高,色譜柱峰形發(fā)生變化如出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、肩峰甚至峰分岔,分離度降低,這些都強(qiáng)烈提示色譜柱受到污染。可采用以下步驟處理:

1. 如系統(tǒng)接有在線過(guò)濾器和保護(hù)柱,首先排查在線過(guò)濾器與保護(hù)柱,進(jìn)行更新替換。日常操作中,當(dāng)壓力升高10%或柱效降低10%時(shí),就應(yīng)考慮更換在線過(guò)濾器和/或保護(hù)柱。

2. 使用高比例的有機(jī)溶劑進(jìn)行沖洗(請(qǐng)注意避免鹽析出,通常可使用梯度升高法,然后維持在高比例甚至100%有機(jī)溶劑條件下)。此操作通常可洗去大部分污染物。

3. 如有機(jī)溶劑清洗不能解決問(wèn)題,可采用如下方法進(jìn)行色譜柱的清洗和再生。根據(jù)樣品性質(zhì)以及你所了解的污染物性質(zhì)選擇清洗方法,用20倍柱體積(即,對(duì)于4.6x250 mm柱,相當(dāng)于80 mL)HPLC級(jí)溶劑清洗色譜柱,將流動(dòng)相溫度升至35-55℃可提高清洗效率。

極性樣品

非極性樣品


1.

1.異丙醇*

選擇1:連續(xù)進(jìn)幾針DMSO(二甲基亞砜),以溶解柱頭析出樣品

2.甲醇

2.THF**

3.THF*

3.二氯甲烷**

選擇210-90%B梯度沖洗,其中A0.1%TFA水溶液,B0.1%TFA乙腈。

4.甲醇

4.正己烷

5.

5.異丙醇

選擇3:使用7M鹽酸胍或7M尿素水溶液(配制后膜過(guò)濾)沖洗色譜柱,促使柱上吸附蛋白樣品變性溶解。

6.流動(dòng)相

6. 流動(dòng)相









* 注意防止緩沖鹽析出,可調(diào)整為適當(dāng)比例的異丙醇和水的混合溶液

** 除非確保您的系統(tǒng)與四氫呋喃和正己烷完全兼容,否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無(wú)法用反相有機(jī)溶劑如乙腈清洗干凈時(shí)才考慮使用。降低流速及操作溫度,并盡量減少系統(tǒng)在四氫呋喃和正己烷中的暴露時(shí)間。

 

4. 可以考慮對(duì)色譜柱進(jìn)行倒沖,特別是當(dāng)問(wèn)題表現(xiàn)為壓力急劇升高,提示有顆粒型物質(zhì)直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時(shí)。操作時(shí),將色譜柱倒接,并與檢測(cè)器斷開(kāi)。使用低流速0.2 ml/min,進(jìn)行過(guò)夜沖洗,并封堵檢測(cè)器入口及出口端以免溶劑揮干產(chǎn)生氣泡。甚或,將色譜柱小心的打開(kāi),直接更換柱入口端篩板。注意!這類操作需要技巧,僅作問(wèn)題確實(shí)無(wú)法得到有效解決時(shí)的最后嘗試,或供某些經(jīng)驗(yàn)豐富的分析操作人員參考使用。


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